每天和分子生物学打交道的小伙伴，想必也经常被引物不特异搞的头晕脑胀，今天小编给大家推荐屡试不爽的引物设计方法，就是用NCBI在线设计，主要步骤如下：

1. 打开NCBI官网，在页面最下方找到“Primer-BLAST”，也可以直接点击（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome）

2. 将目的基因序列粘贴在页面的框框里；

然后可以在“Primer Parameters”条目下将设置上下游起始位置，产物大小，退火温度等重要参数。

为了更好的设计出特异性引物，还可在“Primer Pair Specificity Checking Parameters”条目下将“Organism”后默认的人源种属更改为目的基因来源种属；

单击页面下方“Get Primers”，大功告成了

网站一般会反聩10条引物供选择，可以根据下列条件筛选引物吗，其实也没太大必要，小编直接选用前两对，没问题。

1）连续相同的碱基≤3个；

2）GC所占比例在40%~60%之间；

3）引物自身或两条引物间不能有连续4个碱基互补；

4）引物3’端尽量不要以“A”结尾，但也应避免连续3个“G”或“C”。

初步验证引物特异性

（由于页面显示原因，在设计结果页面上给出的扩增结果有时并不是全部的可能扩增结果，因而需利用Primer-BLAST再次验证）

打开“Primer-BLAST”页面，在“Primer Parameters”条目下的两个框框里分别输入选定引物的正向序列和逆向序列，

在下方修改引物所扩增基因的种属，“Get Primers”，等待数据库测试结果，根据结果判断是否有非特异性扩增，小编经验，只要上面选了相应的种属一般是没有问题的。