为什么有的基因组拼不出来？为什么有的突变二代测序永远看不见？答案可能藏在‘读长’里。

在生命科学领域，测序技术的发展就像计算机芯片一样日新月异。从最早的一代测序（Sanger），到广泛应用的二代测序（NGS），再到如今的第三代测序（long-read sequencing），每一次迭代都在推动基因组学和转录组学研究进入新阶段。

今天，我们将重点介绍三代测序技术，并深入探讨 PacBio 与 Nanopore 两大平台，同时对比二代测序，帮助你快速了解它们的优势与局限。

1.三代测序是什么

第三代测序指能对单个未扩增的 DNA 或 RNA 分子进行直接测序的技术，能够产生千到上万碱基甚至更长的连续读长，常见实现包括纳米孔测序（Oxford Nanopore Technologies，ONT）和单分子实时测序（Pacific Biosciences，PacBio）的 HiFi/SMRT。

三代测序与二代测序比较：

简单来说，二代测序擅长“大规模并行短读长测序”，而三代测序则擅长“单分子长读长测序”。

2.三代测序的两大主流平台

2.1 PacBio：高准确率的长读长

PacBio 的核心技术是 单分子实时测序（SMRT），由美国太平洋生物科学公司（Pacific Biosciences）开发。PacBio SMRT / HiFi（Circular Consensus Sequencing, CCS）：单个 DNA 分子被做成环状模板，在酶驱动下重复读多个循环，生成多次覆盖同一分子后合并成高精度的 HiFi 读（既长又高准）。HiFi 读的准确率可以达到短读长可比的水平（>99%）。

2.1.1 测序原理

PacBio 的测序过程可以形象地理解为“观察 DNA 聚合酶跳舞”：

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  零模波导孔（ZMW）：每个 ZMW 孔只允许单个 DNA 分子进入，背景噪音极低。
  
  


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  荧光标记的核苷酸：四种碱基（A、T、C、G）分别标记不同颜色的荧光。
  
  


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  实时监测：当聚合酶将荧光标记的碱基掺入 DNA 链时，会发出特定颜色的光信号，实时记录碱基序列。
  
  

2.1.2 特点

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  读长：可达 10 kb–100 kb
  
  


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  准确率：HiFi 模式下 >99.9%，和 Illumina 短读长相媲美
  
  


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  应用：基因组组装、结构变异检测、全长转录本测序
  
  

如果说三代测序曾经“长但不准”，PacBio HiFi 就是那个把“长 + 准”结合在一起的方案。

2.2 Nanopore：实时、超长、便携

Nanopore 测序由英国牛津纳米孔公司（Oxford Nanopore Technologies，ONT）开发，是另一种主流的三代测序技术。Oxford Nanopore (ONT)：分子被牵引通过蛋白或固态纳米孔，穿过孔时扰动离子电流产生“squiggle”信号，随后通过 base-calling 将信号转换成碱基序列。优点是实时产出、可做超长读（>100 kb 可达 Mb 级）和便携性强（如 MinION）。

2.2.1 测序原理

Nanopore 的核心是“让 DNA 分子穿过纳米孔，通过电流变化来识别碱基”：

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  纳米孔蛋白：固定在电阻膜上，形成纳米级孔道。
  
  


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  电信号检测：DNA 单链在电场驱动下穿过纳米孔，不同碱基（A、T、C、G）通过时产生独特的电流变化，实时识别碱基序列。
  
  

2.2.2 特点

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  读长：理论上无限，实践中可达 Mb 级
  
  


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  直接测序：能直接读 RNA 和碱基修饰（如甲基化）
  
  


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  便携实时：从 U 盘大小的 MinION 到 PromethION，都可以边测边出结果
  
  

这让 ONT 特别适合 现场测序（比如疫情期间快速检测病原体），也适合研究 超长重复区和端粒序列。

3.三代测序的优势

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  长读长能直接跨越重复序列与结构变异，极大提高基因组拼接与 SV（结构变异）检测的分辨率。
  

  
  
  
  


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  能读取完整转录本（full-length isoforms），无需复杂的拼接（imputation），利于 isoform 定量、TSS/TER 识别和可变剪接研究。
  

  
  
  
  

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  直接检测碱基修饰（如 5mC、6mA）：尤其是纳米孔测序对电流扰动敏感，可用于表观基因组学。
  
  

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  实时与便携（主要指 ONT）：适合现场、快速检测和应急监测（如病原体溯源）。
  
  

4.三代测序的局限与挑战

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  原始错误率差异：早期第三代读序列的错误率高于短读长；但经过技术进步（PacBio HiFi、改进的 ONT base-caller）后已大幅降低——HiFi 可达 ~99.9% 级，ONT 也通过模型和化学改进将错误率显著降低。实际分析中仍需针对性纠错或结合短读数据。
  
  


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  上游样本制备要求高：要得到超长读需要高完整性的超高分子量 DNA，抽提与保存方法对结果影响大。
  
  


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  成本与通量的权衡：虽然单条长读价值高，但在某些高深度短变异检测场景中，短读仍更经济/稳定。不同平台在通量、成本、运行维护上各有差异。
  
  


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  数据分析生态仍在成熟：长读特有的错误模式、修饰信号和更大的文件量对下游工具链提出了更高要求，需要合适的 aligner、纠错、拼接与可视化工具支持。
  
  

不过，随着 PacBio HiFi 和 ONT base-caller 的不断改进，这些问题正在逐步缓解。

5.应用场景

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  高质量基因组组装：尤其是复杂或重复丰富的植物、动物基因组。
  
  


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  结构变异（SV）检测：对大片段插入、缺失、易位和复杂重排更敏感。
  
  


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  全长转录组与 isoform 分析：识别新 isoform、完整 CDS、TSS/TER 使用情况（例如 R2C2 / Mandalorion 等长读法）。
  
  


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  表观基因组学：直接在测序信号中检测 DNA 和 RNA 修饰。
  
  


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  临床与快速检测：病原体测序、耐药性检测、核酸监测（得益于 ONT 的便携与实时）。
  
  

第三代测序在准确性、通量和成本上都在快速进步。想象一下，Illumina 给你的是“拼图碎片”，而 PacBio 和 ONT 给你的是“整张拼好的拼图”。这就是三代测序的魅力。PacBio 的 HiFi 路线把“长读 + 高准确”变为现实，ONT 在化学、孔道与 AI base-caller 的改进上持续推进，使得长期被视为“错误率高”的问题逐步缓解。未来，随着技术的不断进步，三代测序的准确性将进一步提高，成本也将逐渐降低，预计将在更多领域得到广泛应用。

如果你的研究问题涉及 异构转录本、结构变异、复杂基因组拼接或碱基修饰，第三代测序几乎是不可替代的工具。选择平台前请把研究目标、样本特性、预算与计算资源放在第一位，必要时考虑混合策略（长短结合）以兼顾准确率、成本与覆盖范围。