ATAC-Seq剖析教程系列

ATAC-Seq剖析教程：ATAC-seq的背景介绍以及与ChIP-Seq的异同

ATAC-Seq剖析教程：原始数据的质控、比对和过滤

ATAC-Seq剖析教程：用MACS2软件call peaks

ATAC-Seq剖析教程：对ATAC-Seq/ChIP-seq的质量评估（一）phantompeakqualtools

ATAC-Seq剖析教程：对ATAC-Seq/ChIP-seq的质量评估（二）ChIPQC

ATAC-Seq剖析教程：重复样本的处理-IDR

ATAC-Seq剖析教程：用ChIPseeker对peaks进行注释和可视化

ATAC-Seq剖析教程：用网页版东西做功能剖析和motif剖析

ATAC-Seq剖析教程：差异peaks剖析——DiffBind

ATAC-Seq剖析教程：ATAC-Seq、ChIP-Seq、RNA-Seq整合剖析

学习目标：

• 
  学会用MACS2 call peaks
  


• 
  了解MACS2 call peaks的成果
  

Peak Calling

Peak calling即运用核算的办法找出ChIP-seq或ATAC-seq中reads富集的基因组区域。

如下图所示，比对成果的文件中reads在正负链不均匀分布，但在结合位点聚集。正负链5‘末端的reads各形成一组合，通过统计学的办法评估这些组合的分布并和对照组比较，确认这些结合位点是否是明显的。

NOTE：ChIP-seq的剖析办法能够判定两种类型的富集模式：broad domains和narrow peaks。broad
domains，如组蛋白润饰在整个基因body区域的分布；narrow peak，如转录因子的结合。narrow peak相对于broad
或者分散的marks更易被检测到。也有一些混合的结合图谱，如PolII包括narrow和broad信号。

MACS2

peaks calling 有不同的办法，MACS2是最常用的call peaks东西。 MACS全称Model-based Analysis of ChIP-Seq，开始的设计是用来判定转录因子的结合位点，可是它也能够用于其他类型的富集方式测序。

MACS通过整合序列标签方位信息和方向信息进步结合位点的空间分辨率。MACS的工作流如下所示：

MACS2的运用办法

了解相关参数：

输入文件参数：

• 
  -t:实验组，IP的数据文件
  


• 
  c: 对照组
  


• 
  f：指定输入文件的格局，默认是自动检测输入数据是什么格局，支撑bam,sam,bed等
  


• 
  g:有用基因组巨细，因为基因组序列的重复性，基因组实践能够mapping的巨细小于原始的基因组。这个参数要根据实践物种核算基因组的有用巨细。软件里也给出了几个默认的-g
  值：hs – 2.7e9表明人类的基因组有用巨细(UCSC human hg18 assembly).
  
  
  
  • 
    hs: 2.7e9
    
  
  
  • 
    mm: 1.87e9
    
  
  
  • 
    ce: 9e7
    
  
  
  • 
    dm: 1.2e8
    
  
  
  
  

输出文件参数：

• 
  --outdir:输出成果的存储途径
  


• 
  -n:输出文件名的前缀
  


• 
  -B/--bdg:输出bedgraph格局的文件，输出文件以NAME
  ’_treat_pileup.bdg’ for treatment data, NAME ’_control_lambda.bdg’ for
  local lambda values from control显现。
  

peak calling 参数

• 
  -q/--qvalue 和 -p/--pvalue
  
  q value默认值是0.05，与pvalue不能同时运用。
  


• 
  --broad
  
  peak有narrow peak和broad peak, 设置时能够call broad peak 的成果文件。
  


• 
  --broad-cutoff
  
  和pvalue、以及qvalue相似
  


• 
  --nolambda: 不要考虑在峰值候选区域的局部偏差/λ
  
  

  
  

  
  q值与峰宽有必定的联络。抱负情况下，假如放宽阈值，您将简单地取得更多的peaks，可是运用MACS2放松阈值也会导致更宽的peaks。
  

  
  

  
  

Shift 模型参数：

• 
  --nomodel
  
  这个参数和extsize、shift是配套运用的，有这个参数才能够设置extsize和shift。
  


• 
  --extsize
  
  当设置了nomodel时，MACS会用--extsize这个参数从5’->3’方向扩展reads修复fragments。比如说你的转录因子结合规模200bp，就设置这个参数是200。
  


• 
  --shift
  
  当设置了–nomodel，MACS用这个参数从5’ 端移动剪切，然后用–extsize延伸，假如–shift是负值表明从3’端方向移动。建议ChIP-seq数据集这个值坚持默认值为0，对于检测富集剪切位点如DNAsel数据集设置为EXTSIZE的一半。
  
  示例：
  

1. 
   想找富集剪切位点，如DNAse-seq，一切5’端的序列reads应该从两个方向延伸，假如想设置移动的窗口是200bp，参数设置如下：
   
   --nomodel --shift -100 --extsize 200
   


2. 
   对nucleosome-seq数据，用核小体巨细的一半进行extsize,所以参数设置如下：
   
   --nomodel --shift 37 --extsize 73
   

• 
  --call-summits
  
  MACS运用此参数重新剖析信号谱，解析每个peak中包括的subpeak。对相似的结合图谱，引荐运用此参数，当运用此参数时，输出的subpeak会有相同的peak边界，不同的绩点和peak summit poisitions.
  

ATAC-Seq call peaks示例

ATAC-seq关心的是在哪切断，断点才是peak的中心，所以运用shift模型，–shift -75或-100

对人细胞系ATAC-seq 数据call peak的参数设置如下：

macs2 callpeak -t H1hesc.final.bam -n sample --shift -100 --extsize 200 --nomodel -B --SPMR -g hs --outdir Macs2_out 2> sample.macs2.log

MACS2输出文件解读

• 
  NAME_peaks.xls
  
  包括peak信息的tab切割的文件，前几行会显现callpeak时的命令。输出信息包括：
  
  
  
  • 
    染色体号
    
  
  
  • 
    peak开始位点
    
  
  
  • 
    peak结束位点
    
  
  
  • 
    peak区域长度
    
  
  
  • 
    peak的峰值位点（summit position）
    
  
  
  • 
    peak 峰值的高度（pileup height at peak summit, -log10(pvalue) for the peak summit）
    
  
  
  • 
    peak的富集倍数（相对于random Poisson distribution with local lambda）
    
    

    

    
    
    
    Coordinates in XLS is 1-based which is different with BED format
    
    XLS里的坐标和bed格局的坐标还不相同，开始坐标需求减1才与narrowPeak的开始坐标相同。
    
  
  
  
  


• 
  NAME_peaks.narrowPeak
  
  *narrowPeak文件是BED6 4格局，能够上传到UCSC阅读。输出文件每列信息别离包括：
  
  
  
  • 
    1；染色体号
    
  
  
  • 
    2：peak开始位点
    
  
  
  • 
    3：结束位点
    
  
  
  • 
    4：peak name
    
  
  
  • 
    5：int(-10*log10qvalue)
    
  
  
  • 
    6 ：正负链
    
  
  
  • 
    7：fold change
    
  
  
  • 
    8：-log10pvalue
    
  
  
  • 
    9：-log10qvalue
    
  
  
  • 
    10：relative summit position to peak start（？）
    
    

    

    
    
  
  
  
  


• 
  NAME_summits.bed
  
  BED格局的文件，包括peak的summits方位，第5列是-log10pvalue。假如想找motif，引荐运用此文件。
  

  
  

  
  Remove the beginning track line if you want to analyze it by other tools.???
  

  
  

  
  
  • 
    .bdg
    
    bedGraph格局，能够导入UCSC或者转换为bigwig格局。两种bfg文件：treat_pileup, and control_lambda.
    
  
  

  
  

  
  


• 
  NAME_peaks.broadPeak
  
  BED6 3格局与narrowPeak相似，只是没有第10列。
  

summits.bed，narrowPeak，bdg, xls四种类型输出文件的比较：

• 
  xls文件
  
  文件包括信息还是比较多的，和narrowPeak唯一不同的是peak的开始方位需求减1才是bed格局的文件，另外还包括fold_enrichment
  和narrowPeak的fold change 对应，-log10pvalue,-log10qvalue,peak长度，peak 峰值方位等。
  


• 
  narrowPeak文件
  
  和xls文件信息相似
  


• 
  summits.bed文件
  
  包括峰的方位信息和-log10pvalue
  


• 
  bdg文件
  
  bdg文件合适导入UCSC或IGV进行谱图可视化，或者转换为bigwig格局再进行可视化。