ATAC-Seq剖析教程系列

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ATAC-Seq剖析教程：原始数据的质控、比对和过滤

ATAC-Seq剖析教程：用MACS2软件call peaks

ATAC-Seq剖析教程：对ATAC-Seq/ChIP-seq的质量评价（一）phantompeakqualtools

ATAC-Seq剖析教程：对ATAC-Seq/ChIP-seq的质量评价（二）ChIPQC

ATAC-Seq剖析教程：重复样本的处理-IDR

ATAC-Seq剖析教程：用ChIPseeker对peaks进行注释和可视化

ATAC-Seq剖析教程：用网页版工具做功能剖析和motif剖析

ATAC-Seq剖析教程：差异peaks剖析——DiffBind

ATAC-Seq剖析教程：ATAC-Seq、ChIP-Seq、RNA-Seq整合剖析

 

1. 学习方针

• 
  评论ChIP-seq数据质量评价的其他方法
  


• 
  用ChIPQC发生质量计算陈述
  


• 
  鉴定低质量数据的来历
  

• 
  概览图

  

  
  

ENCODE评价数据质量采用多种目标，如前面已经评论过的链相关的目标NSC和RSC。这一节将会评论评价信号散布的其他目标。

NOTE：这里给出的评价目标仅仅反映数据质量的好坏，契合阈值的并不意味着试验是成功的，不契合阈值的也不一定意味着失利。

2.常见质量评价目标的介绍

• 
  

  
  SSD
  

  
  

  
  SSD值是对富集作用的评价。SSD值依赖于全基因组的pile-up信号强度，对实在的ChIP富集和搅扰的强信号区域都很灵敏。SSD值越大标明富集越好。
  

  
  

  
  

  
  “It
  provides a measure of pileup across the genome and is computed by
  looking at the standard deviation of signal pile-up along the genome
  normalised to the total number of reads. ”
  

  
  

  
  


• 
  

  
  FRiP:Fraction of reads in peaks
  

  
  

  
  FRiP表示的是peaks中的reads与总reads的份额。它是另一个反映样本富集作用或IP好坏的评价目标。能够理解为是“信噪比”即文库中结合位点片段占布景reads的份额。一个典型质量好的TF富集FRiP值约5%或许更高，polII的FRiP值约为30%或许更高，也有一些质量好的数据FRiP值<1%（如RNAPIII）
  

  
  


• 
  

  
  Relative Enrichment of Genomic Intervals (REGI)
  

  
  

  
  REGI是对peaks在不同基因组特征位点散布的计算。
  

  
  


• 
  

  
  RiBL: Reads overlapping in Blacklisted Regions
  

  
  

  
  过滤人工形成的高信号区域非常重要，如ENCIDE和modENCODE提供的DAC
  Blacklisted Regions
  track。这些区域经常在特定的重复序列处出现，如着丝粒、端粒、卫星重复序列等，经过简单的比对过滤是不能去除的。来自blacklisted
  regions的信号会形成call peak 和片段长度评价的混淆。
  
  RiBL值能够表示布景信号或input的信号水平，与input sample的SSD值以及input和ChIP sample的读长掩盖值相关。这些区域通常是基因组的0.5%，或许更高的份额（10%）。
  

  
  

  

  
  

3. ChIPQC: quality metrics report

ChIPQC是一个Bioconductor包，输入文件包含BAM和peak文件，能够主动计算一些质量评价值，并发生质量陈述。

预备数据

• 
  BAM files
  
  首要对比对过滤后的bam数据（chr12_aln.bam）建索引，然后将bam和index文件从~/ngs_course/chipseq/results/bowtie2移动到自己的目录文件夹data/bams
  


• 
  peak files
  
  将narrowPeak 文件从macs2目录下~/ngs_course/chipseq/results/macs2 移动到自己目录下data/peakcalls
  


• 
  sampleSheet file
  
  sampleSheet file是仅有需求自己依据试验设计和数据存储地址等信息创立的一个csv格式文件（bam,peak文件分别在比对和call peak的过程发生）。sampleSheet具体需求包含的信息如下：
  
  

  

  
  


• 
  SampleID: 样本ID
  


• 
  Tissue, Factor, Condition: 不同的试验设计对照信息，三列信息必须包含在sampleSheet里，假如没有某一列的信息设为NA。
  


• 
  Replicate : 重复样本的编号
  


• 
  bamReads : 试验组BAM 文件的途径（data/bams）
  


• 
  ControlID : 对照组样本ID
  


• 
  bamControl :对照组样本的bam文件途径
  


• 
  Peaks :样本peaks文件的途径
  


• 
  PeakCaller ：peak类型的字符串，能够是raw,bed,narrow,macs等。
  
  

  
  下载安装ChIPQC
  

  
  

  
  

  source(\"http://bioconductor.org/biocLite.R\")
  
  biocLite(\"ChIPQC\")

  
  

  
  

Running ChIPQC

ChIPQC只需求三步就能够完成质量评价和陈述生成。

• 
  首要载入包和sampleSheet信息
  
  

  
  

  ## Load libraries
  
  library(ChIPQC)
  
  ## Load sample data
  
  samples <- read.csv(\'meta/samplesheet_chr12.csv\')
  
  View(samples)

  
  

  
  


• 
  创立ChIPQC目标
  
  使用sampleSheet的信息读取每个样本的bam和narrowpeak文件，并计算质量评价值，成果存在一个目标里。

  
  

  ## Create ChIPQC object
  
  chipObj <- ChIPQC(samples, annotation=\"hg19\")

  
  

  
  


• 
  生成ChIPQC陈述
  
  

  
  

  ## Create ChIPQC report
  
  ChIPQCreport(chipObj, reportName=\"ChIP QC report: Nanog and Pou5f1\", reportFolder=\"ChIPQCreport\")

  
  

  
  

ChIPQC陈述解读

ChIPQC生成的成果包含一个网页陈述和陈述中含有的一切图片。

网页陈述有三部分：QC Summary ；QC Results；QC files and versions

（1）QC Summary - Overview of results

QC
summary包含sampleSheet里填写的样本的基本信息Tissue,Factor,Condition,Replicate。另外还有上面说到的质量评价的常用目标SSD、RiP%和RiBL值。越高的SSD值标明富集作用越好，Pou5f1样本（2.6,3）有较高的SSD值，RiBL值不是很高，FRiP的份额在5%邻近或许更高，除了Pou5f1-rep2。

• 
  SSD - SSD score (htSeqTools)
  


• 
  RIP% - Percentage of reads wthin peaks
  


• 
  RIBL% - Percentage of reads wthin Blacklist regions
  
  同时表格中还给出了其他计算信息：
  


• 
  Reads - Number of sample reads within analysed chromosomes.
  


• 
  Dup% - Percentage of MapQ filter passing reads marked as duplicates
  


• 
  FragLen - Estimated fragment length by cross-coverage method
  


• 
  FragLenCC - Cross-Coverage score at the fragment length
  


• 
  RelativeCC - Cross-coverage score at the fragment length over Cross-coverage at the read length
  

（2）QC Results - Full QC results and figures

• 
  Mapping, Filtering and Duplication rate
  
  榜首部分是比对、过滤和重复率质检成果，包含Table2 、Figure1和Figure2。
  
  Table 2首要给出了比对质量和重复率，因为BAM文件是过滤后的，所以这里Dup%都是0.
  
  

  

  
  

  
  

  
  
  • 
    Total Dup%-Percentage of all mapped reads which are marked as duplicates.
    
  
  
  • 
    Pass MapQ Filter%-Percentage of all mapped reads whichpass MapQ quality filter
    
  
  
  • 
    Pass MapQ Filter and Dup%-Percentage of all reads which pass MapQ filter and are marked asduplicates.
    
  
  

  
  

  
  

Figure 1展示了reads在blacklists中的份额，

Figure 2是用基因组注释出现了reads在基因组特征方位如启动子的散布。这幅图里显现在启动子区域富集最显着。

• 
  ChIP signal Distribution and Structure
  
  第二部分是ChIP信号散布和结构组成，包含Figure3和4。
  
  Figure 3是一个coverage
  plot， x轴代表在某bp方位read pileup的高度，y轴代表有多少方位有相同的pileup
  高度(取log)。**有好的富集的ChIP样本会有一个tail，即更多的方位（y值大）有较高的测序深度。在我们的数据会集Nanog样本与Pou5f1
  相比有较高的tails,尤其是重复样本2。可是Pou5f1有较高的SSD值。当SSD高可是coverage看起来低时，或许是存在大片段深度高的区域出现在blacklist
  基因组区域。
  


• 
  Peak Profile and ChIP Enrichment
  
  第3部分是peak的谱图和ChIP的富集，每个peak都会集在summit方位（summit 理解为peak的最高峰值点处）
  

  

  
  


• 
  peak的性状取决于研究目标的类型，如转录因子、组蛋白标记、或其他DNA结合蛋白如聚合酶等，相同类型的目标通常有共同特征的谱图。
  
  Figure6和7都是对比对到peak中的reads计算。富集作用好的ChIP样本的reads与peaks会有高份额的重合。尽管Nanog有较高的RiP,可是两个重复样本间的差异大于Pou5f1。
  


• 
  Figure8和9**表示样本的聚类作用，分别是相关性聚类热图和PCA。
  

4. 试验误差：ChIP-seq数据质量低的来历

• 
  免疫沉淀的特异性和有效性
  
  影响因素如抗体的特异性，结和沉淀的强度
  


• 
  片段化
  
  超声裂解发生不同大小的片段或许引进误差
  


• 
  文库构建时的误差
  
  如PCR扩增