# 我习惯将数据保存到项目文件夹下的data中



mkdir -p GSE42466/data/chip-seq



cd GSE42466/data/chip-seq



for ((i=204;i<=209;i++));



do



  wget -4 -q ftp://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sra-instant/reads/ByStudy/sra/SRP/SRP017/SRP017311/SRR620$i/SRR620$i.sra;



  ~/miniconda/envs/biostar/bin/fastq-dump –split-3 SRR620$i.sra;



done &

# 索引大小为3.2GB， 不建议自己下载基因组构建



mkdir referece && cd reference



wget -4 -q ftp://ftp.ccb.jhu.edu/pub/data/bowtie2_indexes/mm10.zip



unzip mm10.zip

curl \'https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTables?hgsid=603641571_MKLxB78UAcjaI3oj5YiFCA0Ms86o&boolshad.hgta_printCustomTrackHeaders=0&hgta_ctName=tb_refGene&hgta_ctDesc=table+browser+query+on+refGene&hgta_ctVis=pack&hgta_ctUrl=&fbQual=whole&fbUpBases=200&fbExonBases=0&fbIntronBases=0&fbDownBases=200&hgta_doGetBed=get+BED\' > mm10_refSeq.bed

得到的fastq文件，一般而言都是上机得到的原始数据，也有可能是经过质量控制的结果，但是无论如何都得自己去检查一下。

 

## 需要安装fastqc 和 multiqc



# 先获取QC结果



ls *gz | while read id; do fastqc -t 4 $id; done



# multiqc



multiqc *fastqc.zip --pdf

根据质控结果，发现序列的前后几个碱基质量不好，因此在比对的时候会主动忽略。

今后，可能会去下载其他实验的数据，还要进行质量控制，所以就写一个Python脚本进行流程化操作。脚本命名为sra2qc.py，保存在我的GitHub上

序列比对

这一步非常简单， 就是将得到fastq文件用bowtie2比对小鼠参考基因组上，

 

bowtie2 -p 6 -3 5 --local -x reference/mm10 -U ChIP-Seq/SRR620204.fastq | ~/miniconda3/bin/samtools sort -O bam -o ../analysis/alignment/ring1B.bam



bowtie2 -p 6 -3 5 --local -x reference/mm10 -U ChIP-Seq/SRR620205.fastq | ~/miniconda3/bin/samtools sort -O bam -o ../analysis/alignment/cbx7.bam



bowtie2 -p 6 -3 5 --local -x reference/mm10 -U ChIP-Seq/SRR620206.fastq | ~/miniconda3/bin/samtools sort -O bam -o ../analysis/alignment/suz12.bam



bowtie2 -p 6 -3 5 --local -x reference/mm10 -U ChIP-Seq/SRR620207.fastq | ~/miniconda3/bin/samtools sort -O bam -o ../analysis/alignment/RYBP.bam



bowtie2 -p 6 -3 5 --local -x reference/mm10 -U ChIP-Seq/SRR620208.fastq | ~/miniconda3/bin/samtools sort -O bam -o ../analysis/alignment/IgGold.bam



bowtie2 -p 6 -3 5 --local -x reference/mm10 -U ChIP-Seq/SRR620209.fastq | ~/miniconda3/bin/samtools sort -O bam -o ../analysis/alignment/IgG.bam

我对比对结果进行了简单的统计，发现比对率其实不太高. 虽然在RNA-Seq是要求80~90%的比对率，但是在ChIP-Seq上，我没有具体了解过。

样品	比对到单个区域	比对到多个区域
ring1B	43.76%	15.81%
cbx7	39.39%	17.49%
suz12	48.88%	17.17%
RYBP	58.76%	28.12%
IgGold	54.54%	27.21%
IgG	57.83%	25.45%

比对的结果，可以打开IGV查看，和RNA-Seq最大的区别在于你能看到明显的峰，这就是peak。这类peak在全基因组上特别的多，我们无法用肉眼直接选择，因此就需要借助专门的工具查找。

一般ChIP-Seq都需要提供一个对照组，也就是图中IgG。很明显的发现其他实验组有峰的区域在对照组中是没有的。而实验组没有峰的区域，对照组也没有，这样子就能提出背景噪声。

peak calling

peak calling要用到MACS, 建议用ananconda安装, 因为可以选择合适的Python环境。

 

conda create -n macs python=2



source activate macs



pip install MACS2

macs2包含一系列的子命令，其中最主要的就是callpeak， 官方提供了使用实例

 

macs2 callpeak -t ChIP.bam -c Control.bam -f BAM -g hs -n test -B -q 0.01

一般而言，我们照葫芦画瓢，按照这个实例替换对应部分就行了，介绍一下各个参数的意义

• 
  -t: 实验组的输出结果
  


• 
  -c: 对照组的输出结果
  


• 
  -f:
  -t和-c提供文件的格式，可以是\"ELAND\", \"BED\", \"ELANDMULTI\", \"ELANDEXPORT\",
  \"ELANDMULTIPET\" (for pair-end tags), \"SAM\", \"BAM\", \"BOWTIE\",
  \"BAMPE\" \"BEDPE\" 任意一个。如果不提供这项，就是自动检测选择。
  


• 
  -g: 基因组大小， 默认提供了hs, mm, ce, dm选项， 不在其中的话，比如说拟南芥，就需要自己提供了。
  


• 
  -n: 输出文件的前缀名
  


• 
  -B: 会保存更多的信息在bedGraph文件中，如fragment pileup, control lambda, -log10pvalue and -log10qvalue scores
  


• 
  -q: q值，也就是最小的PDR阈值， 默认是0.05。q值是根据p值利用BH计算，也就是多重试验矫正后的结果。
  


• 
  -p： 这个是p值，指定p值后MACS2就不会用q值了。
  


• 
  -m: 和MFOLD有关，而MFOLD和MACS预构建模型有关，默认是5：50，MACS会先寻找100多个peak区构建模型，一般不用改，因为你不懂。
  

原文写到：MACS
estimated the FDR by comparing the peaks obtained from the samples with
those from the control samples, using the same p value cutoff (10e-5).
估计就是指文章用了q=0.05或0.01

 

macs2 callpeak -c IgGold.bam -t suz12.bam -q 0.05 -f BAM -g mm -n suz12 2> suz12.macs2.log &



macs2 callpeak -c IgGold.bam -t ring1B.bam -q 0.05 -f BAM -g mm -n ring1B 2> ring1B.macs2.log &



macs2 callpeak -c IgG.bam -t cbx7.bam -q 0.05 -f BAM -g mm -n cbx7 2> cbx7.macs2.log &



macs2 callpeak -c IgG.bam -t RYBP.bam -q 0.01 -f BAM -g mm -n RYBP 2>RYBP.macs2.log &

可以看下找到了多个peak，

 

wc -l *bed



  2384 cbx7_summits.bed



  8342 ring1B_summits.bed



     0 RYBP_summits.bed



  7619 suz12_summits.bed

结果显示RYBP无peak，估计是数据上传错误，我们可以下载作者上传的peak数据。此外ring1B我找了8000多个，但是原文是7000个，或许要修改阈值。

 

wget ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/geo/series/GSE42nnn/GSE42466/suppl/GSE42466_Suz12_peaks_10.txt.gz



gzip -d GSE42466_Suz12_peaks_10.txt.gz



mv GSE42466_RYBP_peaks_5.txt RYBP2_summits.bed

结果文件不只是上述提到的一类，还有如下格式：

• 
  NAME_peaks.xls: 以表格形式存放peak信息，虽然后缀是xls，但其实能用文本编辑器打开，和bed格式类似，但是以1为基，而bed文件是以0为基.也就是说xls的坐标都要减一才是bed文件的坐标
  


• 
  NAME_peaks.narrowPeak
  NAME_peaks.broadPeak 类似。后面4列表示为， integer score for display，
  fold-change，-log10pvalue，-log10qvalue，relative summit position to peak
  start。内容和NAME_peaks.xls基本一致，适合用于导入R进行分析。
  


• 
  NAME_summits.bed：记录每个peak的peak summits，话句话说就是记录极值点的位置。MACS建议用该文件寻找结合位点的motif。
  


• 
  NAME_model.r，能通过$ Rscript NAME_model.r作图，得到是基于你提供数据的peak模型。
  

这一部分的工作主要是学习MACS2软件使用方法和参数的含义，难度不大。目标是找到候选靶基因。

结果注释和可视化

当我们得到上一步的输出文件后，下一步就是得到文章的结果。用的是Y叔的ChIPseeker，一个充满故事的R包，搜索一下就能看到Y叔的往事。

ChIPseeker的功能分为三类:

• 
  注释：提取peak附近最近的基因， 注释peak所在区域
  


• 
  比较：估计ChIP peak数据集中重叠部分的显著性；整合GEO数据集，以便于将当前结果和已知结果比较
  


• 
  可视化： peak的覆盖情况；TSS区域结合的peak的平均表达谱和热图；基因组注释；TSS距离；peak和基因的重叠
  

完全符合我们的需要，都不需要用到bedtools和deeptools。

在正式的工作开始之前，我们需要加载ChIPseeker, 基因组注释包和bed数据

 

# biocLite(\"ChIPseeker\") # biocLite(\"org.Mm.eg.db\") # biocLite(\"TxDb.Mmusculus.UCSC.mm10.knownGene\") library(\"ChIPseeker\")



# 根据自己存放文章具体地址修改，保证导入的数据是BED格式



ring1B <- readPeakFile(\"F:/Data/ChIP/ring1B_peaks.narrowPeak\")



cbx7 <- readPeakFile(\"F:/Data/ChIP/cbx7_peaks.narrowPeak\")



RYBP <- readPeakFile(\"F:/Data/ChIP/RYBP2_summits.bed\")



suz12 <- readPeakFile(\"f:/Data/ChIP/suz12_peaks.narrowPeak\")

得到最基本的peak数据后，我们要做以下事情

• 
  大量的韦恩图，描述不同蛋白结合基因的关系
  


• 
  不同蛋白在染色体结合位点与TSS的距离
  

为了完成上面说的两件事情，我们需要注释peak，准备TSS所在位置然后把peak比对到这些区域.

注： 原文提供不同蛋白的交集的基因TSS区域，所以要先做注释。

关于peak注释一定要多说几句：

• 
  启动子区域目前没有明确定义，一般认为基因起始转录位点的上下游区域是启动子区域，文章认为是TSS2.5 kb 以内都是靶基因
  


• 
  注释有两类，genomic annotation和nearest gene annotation. 前者是研究直接调控对象，后者是做基因表达调控
  


• 
  还有一类注释就是简单看peak上下游的范围的基因
  

根据文章得知需要距离TSS一定距离的注释，以及peak上下5 Kb 的注释

Genes
with a peak within the gene body, or within 2.5 kb from the TSS, were
considered to be target genes. An area of 5 kb surrounding each TSS that
was associated to one or more ChIP-seq (RYBP, Ring1B, Cbx7, Suz12, or
H2AK119ub) was used to calculate the ChIP-seq profile and the whole
ChIP-seq coverage.

ChIPseeker负责注释的就是annotatePeak，提供了3类注释方式，符合文章的要求

# 对于非向量的循环，推荐构建list，然后用lapply peaks <- list(ring1B, cbx7, RYBP, suz12) # 注释 peakAnnoList <- lapply(peaks, annotatePeak, tssRegion=c(-2500,2500), TxDb=txdb, 



                       addFlankGeneInfo=TRUE, flankDistance=5000)

结果可以用as.GRanges或者as.data.frame查看。

as.GRanges(peakAnnoList[[1]])



as.data.frame(peakAnnoList[[1]])

得到的结果会在原先的bed文件中增加额外的注释信息，你可以和之前导入的数据进行比较，比如说geneId, transcriptId,distanceToTSS,flank_txIds等。这些都保存后续作图所需要的信息。我们可以先看不同蛋白的靶位点的注释情况，

 

plotDistToTSS(peakAnnoList)

原文大量的是不同蛋白结合基因的韦恩图，我们可以用更有趣的UpSet的点图

 

genes= lapply(peakAnnoList, function(i) as.data.frame(i)$geneId)



library(UpSetR)



upset(fromList(genes))

UpSet技术适用于多于5个集合表示情况，对于两个蛋白的靶基因的比较，大家更加喜欢韦恩图的。

 

vennplot(genes[1:2])

简单的韦恩图

感觉没有原文那么高大上，主要原因就是没有上色，可以自行搜索找合适的软件作图。关于不同蛋白靶基因的集合关系图基本上就是这样子。

下面是根据靶基因间的交集，绘制TSS距离图，比如说四个蛋白的重叠基因。

# 准备TSS区域，然后将peak映射到这些区域，得到tagMatrix



fourgenes <- intersect(genes[[1]],intersect(genes[[2]],intersect(genes[[3]],genes[[4]])))



target <- select(txdb, keys=fourgenes, columns=c(\"TXID\",\"GENEID\"), keytype = \"GENEID\")



promoter <- promoters(txdb, upstream = 2500, downstream = 2500)



target_promoter <- promoter[promoter$tx_id %in% target$TXID]



tagMatrixList <- lapply(peaks, getTagMatrix, window=target_promoter)



plotAvgProf(tagMatrixList , xlim = c(-3000,2999))

感觉和原图有那么一点像，还可以画个热图

tagHeatmap(tagMatrixList, xlim=c(-2999, 3000), color=NULL)